Enseignement

I/ DEFINITION, GENERALITES

L’ADN est le constituant génétique essentiel des cellules transmettant l’information sous forme codée de cellule à cellule et d’organisme à organisme. A l’intérieur des cellules, le DNA n’est pas libre, mais forme un complexe avec des protéines spécifiques, l’ensemble forme la chromatine. Le noyau contient une quantité constante d’ADN représentant le matériel génétique. L’information génétique reste inchangée durant la différenciation des tissus somatiques. Cette situation est due à un nombre de chromosomes constant dans les cellules somatiques, ce nombre de chromosomes est de 46 (2n).
Les chromosomes sont constitués d’une molécule d’ADN associée à de nombreuses protéines ; ils servent de support à l’information génétique .Le nombre de chromosomes par cellule est une caractéristique d’espèce ; dans l’espèce humaine, il y a 46 chromosomes (23 paires) et donc 46 molécules d’ADN par cellule diploïde

Les chromosomes ne sont visibles que pendant une courte période du cycle cellulaire .En effet ils représentent la forme la plus condensée que peut prendre une molécule d’ADN .cette condensation extrême, si elle empêche toute transcription des gènes, permet une ségrégation correcte des molécules entre les deux cellules filles au cours des divisions cellulaires.
Entre chaque division, les molécules d’ADN se décondensent, et ne sont plus visibles individuellement : elles constituent dans leur ensemble la chromatine du noyau inter phasique. Au moment d’une division cellulaire, après s’être dupliquée, chaque molécule d’ADN se condense et devient visible au microscope sous forme d’un chromosome.

II/ INTERET.

1-Historique :
La cytogénétique, pratiquement née avec le vingtième siècle, est une discipline jeune .La connaissance de l’organisation des chromosomes a permis de rendre compte des particularités et des variations de l’ADN constitutif. A l’heure actuelle, l’apport cytogénétique est devenu indispensable à plusieurs pathologies humaines. On décrit quatre périodes

1.1.- La première période : 1891 – 1952 débute par le travail d’un cytologiste D. Von Hanseman qui en 1891 dénombre le premier 18, 24 et plus de 40 chromosomes dans les 3 cellules de tissu humain normal.
D’autres observations donnent lieu à des estimations contradictoires du nombre somatique normal à 48 chromosomes. Tous les auteurs ont utilisé des techniques d’histologie classique sur des prélèvements post-mortem de testicule humain.

En 1912, Winiwarter améliore cette technique en prenant des biopsies de testicules prélevés chirurgicalement, immédiatement fixés et coupés à une épaisseur de 5 et 7,5mm permettant de garder intact l’ensemble de la garniture chromosomique. A la suite de ces améliorations techniques, Winiwarter conclut à la présence de 47 chromosomes dans les spermatogonies (46A + X) et de 48 (46 + X+ X) dans les ovogonies et à un mécanisme du déterminisme du sexe à XX XO. Le chromosome Y est décrit plus tard par Painter (1921, 1922) comme un élément petit et non apparié et conclut en 1923 à l’existence de 46 + X + Y pour l’homme et à 46 + X + X pour la femme et à un mécanisme du déterminisme du sexe liée à la formule XX ou XY (Painter 1923).

1.2- La deuxième période = 1952 – 1959 :
Cette période commence avec la découverte fortuite, en 1952, par HSU, du prétraitement par le choc hypotonique des préparations chromosomiques obtenues in vitro à partir de cellules de tissu splénique. Cette nouvelle technique favorise le gonflement cellulaire, la dispersion des chromosomes et permet une meilleure individualisation de ceux-ci. A la suite de cette découverte deux cytologistes, Albert Levan et Joe Hir Tjio, en 1956 déterminent le nombre de 46 chromosomes dans les cellules somatiques humaines. Cette découverte est à la base de l’étude systématique du caryotype humain.

1.3- La troisième période : 1959 – 1969
Elle commence par la publication le 26 Janvier 1959 par Lejeune, Gauthier et Turpin dans les comptes rendus de l’académie des sciences de Paris de la présence chez neuf enfants Mongoliens, d’un petit chromosome acrocentrique surnuméraire. Cette découverte marque la naissance de la « cytogénétique clinique ». Depuis cette date, l’importance diagnostique de la cytogénétique n’a cessé de croître. Un effort collectif des cytogénéticiens et des cliniciens pour rechercher dans les anomalies congénitales une éventuelle étiologie chromosomique. Rapidement différentes anomalies de nombre et de structure chromosomique sont décrites.
En 1960, Peter Nowell a eu l’idée d’utiliser la phytohémaglutinine pour l’étude des cellules sanguines. Cette substance capable d’une action mitogène sur les lymphocytes, induit leur transformation blastique et dès lors, permet l’étude du caryotype à partir d’un simple prélèvement sang périphérique.

1.4- La quatrième période: après 1969
C’est la periode du banding chromosomique. La première technique de banding est due à Caspersson, qui utilise la moutarde de quinacrine pour individualiser chaque chromosome, par l’apparition de bandes caractéristiques : Les bandes Q Capersson 1969, 1970.
D’autres techniques sont rapidement mises au point : Le banding G : Seabright 1971le banding R : Dutrillaux et Lejeune 1971, le banding C : Summer et al. 1971, le banding NOR : Howell et al 1975.
La découverte des bandes chromosomiques va améliorer considérablement les potentialités d’analyses, et permet la reconnaissance plus aisée des anomalies chromosomiques.

1.5- La cytogénétique hématologique :
Nowell et Hunger Ford en 1960 découvrent la première anomalie chromosomique en hématologie : le chromosome Philadelphie ou t (9 ; 22) et montrent qu’une translocation spontanée peut survenir entre deux chromosomes de façon indépendante et répétée.

2-clinique
La découverte des bandes chromosomiques a amélioré considérablement les potentialités d’analyses et a permis la reconnaissance plus aisée des anomalies chromosomiques. Actuellement la cytogénétique apparaît comme une science à part entière et Plusieurs spécialités se sont développées :
- Etudes des anomalies chromosomiques constitutionnelles.
- Dépistage anténatal des aberrations chromosomiques.
- Analyse des anomalies chromosomiques acquises présentes dans les cancers et les leucémies ou consécutives à l’exposition aux radiations ionisantes, à des substances toxiques ou des agents mutagènes.
- Localisation des gènes ou de segment d’ADN sur les chromosomes, ayant pour objectif l’etablissement d’une carte chromosomique plus intégrée, du génome humain.

3-Diagnostic
Certaines anomalies chromosomiques permettent de poser un diagnostic positif et différentiel c’est ainsi que la t (9 ; 22) permet de poser aisément le diagnostic de la LMC et d éléminer les autres syndromes myéloproliferatifs.

4-Pronostic
Le caryotype s’est affirmé comme un indicateur de premier plan du devenir de certaines hémopathies. Il est de plus en plus souvent pris en compte pour l’orientation thérapeutique.
5-Thérapeutique
L’étude de caryotype permet d’évaluer la réponse cytogénétique d’un traitement , de cibler les anomalies cytogénétiques par des thérapeutiques nouvelles et appropriées et enfin de rechercher la maladie résiduelle.

III /Structure et ultra Structure des chromosomes.

1- Structure du chromosome.
Un chromosome est formé d’une longue molécule d’ADN. Chaque molécule d’ADN formant un chromosome possède un centromère, deux télomères et des origines de réplication.

1-1/ Centromère :
Cet élément permet d’attacher la molécule d’ADN au fuseau mitotique pendant la mitose.

1-2 / Télomères :
Ce sont des séquences d’ADN particulières situées a chaque extrémité d’un chromosome linéaire, Celles ci s’allongent périodiquement a chaque cycle de réplication par une enzyme particulière, compensant ainsi la perte de quelques nucléotides de l’ADN lors de la réplication
.
1-3/Origine de réplication :
L’origine de réplication est une séquence de nucléotide particulière, qui initie la réplication de la molécule d’ADN, ce qui permet de séparer ses deux copies à la mitose et de se conserver d’une génération cellulaire a l’autre.

2/ ultra structure du chromosome
Chaque chromosome est formé d’une molécule d’ADN et de protéines liées à cet ADN.
L’ADN est composé d’acides desoxyribonucleiques formant une double hélice autour des
protéines qui sont de deux types, histones et non histones.

2-1 / Les protéines Histones :
Ces protéines sont présentes dans le noyau en proportions constantes par rapport au DNA, et constituent les principales protéines de structure des chromosomes eucaryotes. Elles sont présentes en quantité si importante que leur masse totale dans la chromatine avoisine celle du DNA. Les histones sont des protéines relativement petites, contenant une très forte proportion d’acides aminés chargés positivement, indépendamment de sa sequence.Il existe cinq types d’histones divisées en deux groupes principaux : les histones nucléosomiques et les histones H1. Les histones nucléosomiques sont de petites protéines (102 à 135 résidus d’acides aminés) responsables de l’enroulement de l’ADN, ces quatre histones sont appelées H2A, H2B , H3 et H4.
Le nucléosome est l’unité fondamentale d’empaquetage de la chromatine .Un traitement par les nucléases peut débobiner cet empaquetage très ordonné de la chromatine. A la suite de ce traitement , la chromatine apparaît en microscopie électronique comme un « collier de perles ». Les perles ou nucléosomes forment des disques de 11nm de diamètre environ , constitués de deux copies de chacune des quatre histones nucleosomiques pour former un octamere d’histones. Il forme le noyau protéinique autour duquel l’hélice d’ADN bicatenaire est enroulée deux fois. Ces fragments d’ADN bicatenaire sont longs de 146 paires de nucléotides. L’ADN s’étend comme un fil continu , allant de nucléosome en nucleosome.Chaque nucléosome est séparé du suivant par un segment d’ADN internucleosomique. Les nucléosomes sont empilés pour former des structures régulières d’ordre supérieur. Les histones H1 participent à l’empilement des nucléosomes.

2-2/ Les protéines non histones : Les chromosomes contiennent une variété de protéines liées a des séquences spécifiques d’ADN .Les protéines non histone sont hétérogènes et varient d’un tissu à l’autre. L’information stockée dans l’ADN est organisée, répliquée et lue par une variété de protéines de liaison à l’ADN.

Les chromosomes mitotiques sont formés de chromatine dans son état condensée .Au cours de la mitose, les chromosomes se condensent et s’enroulent. Cette condensation se fait grâce à des phénomènes de phosphorylation sur ses cinq résidus serine. Au stade métaphasique de la mitose, les deux nouvelles molécules d’ADN sont repliées séparément pour donner deux chromosomes identiques (appelés chromatides sœurs), maintenus ensemble au niveau de leurs centromères. En microscopie électronique, chaque chromatide est organisée en boucles de chromatines partant d’un axe central.
Pendant l’interphase, les chromosomes sont suffisamment étendus, fins et enchevêtrés pour que leurs boucles soient facilement observables en ultrastructure.

IV/ Méthodes d’étude des chromosomes :

Deux artifices techniques ont permis le développement initial de la cytogénétique humaine : l’emploi d’une solution hypotonique pour faire gonfler les cellules (choc hypotonique) et le séchage à l’air qui complète l’étalement des chromosomes.

2.1-Cytogénétique conventionnelle
L’examen des chromosomes est habituellement effectué au stade de métaphase. Il est donc nécessaire d’obtenir des cellules en division pour en faire l’analyse.
Tout tissu prélevé stérilement dont les cellules sont capables de se diviser, peut être utilisé.

2.1.1- Prélèvement :
Le caryotype hématologique se fait à partir d’un prélèvement sanguin périphérique, d’un prélèvement de moelle osseuse ou ganglionnaire par une seringue héparinée, qui sera immédiatement receuilli dans un tube stérile contenant un milieu de culture fait d’un mélange de RPMI et d’héparine.

2.1.2- Mise en culture :
Le prélèvement est acheminé aussitôt au laboratoire où une mise en culture est faite : dans un milieu contenant du RPMI, du sérum de veau fœtal, de la L.Glutamine des antibiotiques et de l’héparine. Cette préparation est mise en incubation dans une étuve à CO2 de 24h à 72h selon le type de leucémie aiguë les mitogènes sont peu employés sauf dans des cas particuliers car ils peuvent stimuler la division des cellules non malignes.

2.1.3- Blocage des mitoses
Les mitoses sont bloquées en métaphase, en incubant les cellules se multipliant le plus activement possible en présence d’un poison du fuseau mitotique telle que la colchicine qui dépolymérise la tubuline du fuseau.

2.1.4- Choc hypotonique :
Les cellules sont gonflées par un milieu hypotonique (solution de potassium) ce qui désorganise leur architecture interne et permet la dispersion des chromosomes.

2.1.5-Fixation les cellules sont ensuite fixées, par un mélange de méthanol et d’acide acétique, étalées sur des lames de verre, par le dépôt de la suspension cellulaire et en s’évaporant, le fixateur provoque la rupture de la membrane cellulaire et l’étalement des chromosomes sur le verre (1).

2.1.4-denaturation : les lames fixées seront dénaturées et colorées par plusieurs colorants permettant l’apparition des bandes chromosomiques qui est la mise en évidence d’une succession de bandes claires et sombres de topographie spécifique sur tous les chromosomes ,c’est la techniques de banding . Il existe essentiellement deux types de dénaturation ,enzymatique par la trypsine (bandes G) et thermique par la chaleur (bandes R)
Les principaux types sont :

• Les bandes Q = pour quinacrine = nom du colorant qui nécessite l’observation en fluoréscence.
• Les bandes G = obtenue après l’action de la trypsine et une contre coloration au Giemsa mais dont il existe de nombreuses variantes.
• Les bandes R après dénaturation à la chaleur et contre coloration au Giemsa,elles montrent une séquence de bande inverse de celle des bandes G et Q sur chaque chromosome.
• Les bandes C pour centromère après coloration au sulfate de baryium qui marquent les régions péricentromériques et la partie distale du chromosome Y.
Les régions marquées par les bandes C correspondant à l’hétéro chromatine, définie
Comme un type de chromatine condensée dans le noyau inter phasique où elle est
Colorée plus intensément que la chromatine décondensée ou euchromatine.
• des bandes T : colorent préférentiellement les régions télomériques des chromosomes.
• NOR enfin les techniques de colorations des satellite, par le nitrate d’argent, ou = organisateur nucléolaires correspondant aux régions du génome contenant les gènes qui codent pour les ribosomes

2.1.5 Prise de photo et établissement du caryotype
les métaphases observées au microscope optique sont photographiées et un tirage sur papier est réalisé .Les chromosomes sont découpés et classés selon la nomenclature internationale Le résultat de classement constitue un caryotype.
Actuellement Les laboratoires disposent de matériel informatique permettant l’acquisition d’images numériques via une camera et surtout l’analyse et le classement des chromosomes directement sur écran permettent l’établissement du caryotype .
L’avantage de ces systèmes fait que la photographie n’est plus nécessaire, puisque l’image est directement enregistrée à partir du microscope, néanmoins, le classement semi automatique des chromosomes nécessite l’intervention d’un observateur entraine pour corriger les erreurs de la machine .

2.2- Autres méthodes :

2.2.1- Cytogénétique et cytométrie en flux :

La cytométrie en flux est une technologie qui permet d’analyser les paramètres (taille fluorescence) caractérisant les cellules en suspension. Appliqué à des préparations de chromosomes en suspension, cet ensemble de technique a permis d’établir le caryotype en flux, en caractérisant individuellement les chromosomes en fonction de leur longueur relative et leur contenu en ADN.
L’évaluation de ce contenu en ADN des cellules leucémiques apparaît actuellement comme une méthode rapide qui permet la définition d’un facteur pronostique indépendant dans des analyses multi variées: l’index en ADN. Il s’agit du rapport du contenu modal en ADN de cellules leucémiques en GO/G1 sur celui des cellules normales. Il est étroitement corrélé à la ploïdie. Cette technique ne peut cependant évaluer les anomalies de structure comme les translocations.

2.2.2- Hybridation in situ en fluorescence ou fish :

L’hybridation in situ sur chromosome a d’abord été développée avec des sondes marquées radio activement dans le but de localiser des gènes. Au cours des années 1980 – des techniques de FISH (fluorescence in situ hybridation), utilisant des sondes moléculaires associés à des fluorochromes, ont été mises au point. Les sondes peuvent correspondre à des séquences répétées ou uniques d’ADN où des insert d’ADN génomique de plus grande taille contenus dans différents vecteurs.
La multiplicité des fluorochromes utilisables offre des moyens nouveaux qui permettent non seulement de localiser des gènes mais aussi d’analyser les anomalies de nombre et de structure des chromosomes.

La possibilité d’employer simultanément plusieurs fluorochromes augmente en effet considérablement l’efficacité des techniques FISH. L’hybridation sur chromosomes métaphasiques permet par exemple, de détecter des anomalies de structure, notamment les translocations, soit en décorant un ou plusieurs chromosomes entiers avec des sondes spécifiques de ces chromosomes (chromosomes painting) soit en utilisant des sondes moléculaires correspondant à des gènes ou à des séquences d’ADN dont la localisation sur le chromosome est connue. On peut ainsi définir entre quels marqueurs moléculaires sont situés les points de cassure chromosomique et par conséquent les localiser, par référence à des cartes chromosomiques connues.

V/ La nomenclature cytogénétique :

La nomenclature des chromosomes humains a été initialement établie dans une conférence internationale en 1960. Elle a été régulièrement actualisée pour inclure les terminologies, pour décrire les anomalies chromosomiques, les bandes chromosomiques, les bandes de haute résolution et plus récemment les résultats de l’analyse FISH. La nomenclature la plus récente a été publiée en 1995.
L’analyse cytogénétique visualise chaque chromosome comme deux chromatides qui sont réunies par un étranglement central appelé centromère. Le centromère est la région où le chromosome est attaché au fuseau pendant la mitose. Le centromère divise le chromosome en 2 bras : un bras court appelé le bras p (p pour petit) et un bras long désigné sous le bras q (q a été choisie simplement parcequ’elle est la lettre qui suit la lettre p. Conventionnellement les chromosomes sont toujours représentés avec le bras p en haut.
Les chromosomes ont été décrits initialement en fonction de leur taille et de la position du centromère. La taille était caractérisée comme grande, moyenne ou petite .par convention ils sont classes du plus grand au plus petit. La position du centromère a permis de calculer l’index centromerique, défini par le rapport du bras court sur la taille totale du chromosome,permettant de classer les chromosomes en trois familles ; médiocentrique, acrocentrique et submétacentrique. Dans les chromosomes médiocentrique, le centromère est à peu près au milieu du chromosome, de telle sorte que le bras p et le bras q sont grossièrement de longueur égale. Les chromosomes acrocentriques ont un centromère situé à l’une des extrémités du chromosome, de telle sorte que le bras p est beaucoup plus court que le bras q. Les chromosomes submétacentriques ou télocentriques ont un centromère qui est en position intermédiaire avec des bras courts qui sont grossièrement la moitié de la longueur des bras longs.

En 1963, avant la mise au point du banding chromosomique, les chromosomes humains ont été divisés en sept groupes de A à G en fonction de leur taille et la position du centromère.
• Le groupe A comprend les chromosomes 1,2 et 3 qui sont de grands chromosomes métacentriques.
• Le groupe B comprend les chromosomes 4 et 5, qui sont grands et submétacentriques.
• Le groupe C comprend les chromosomes 6 à 12 et le chromosome X, sont de taille moyenne et métacentriques ou submétacentriques.
• Le groupe D comprend les chromosomes 13 à 15 qui sont des chromosomes acrocentriques de taille moyenne avec les satellites.
• Le groupe E, les chromosomes 16 à18, comprend le petit chromosome métacentrique (chromosome 16) et les chromosomes submétacentriques 17 et 18.
• Le groupe F comprend les chromosomes 19 et 20 qui sont petits et métacentriques.
• Le groupe G inclue les chromosomes 21, 22 et Y qui sont petits et acrocentriques ; les chromosomes 21 et 22 ont des satellites, tandis que le chromosome Y n’en possède pas.

En l’absence du banding chromosomique, les chromosomes au sein de quelques groupes ne peuvent être distingués. Le banding permet d’identifier les chromosomes de chaque groupe et de distinguer les uns des autres.
La nomenclature a été ensuite établie pour décrire la structure de chaque chromosome. Le terme landmark ou repère, est utilisé pour désigner les caractères morphologiques importants qui identifient les chromosomes. Les repères comprennent le centromère, les extrémités des chromosomes (appelées télomères) et les bandes chromosomiques proéminentes. Les régions des chromosomes sont définies comme des aires situées entre des repères adjacents. Le nombre de régions sur les bras courts et longs de chaque chromosome est compris entre 1 et 4. Les régions de chaque bras chromosomique sont comptées à partir du centromère vers le télomère.
Les bandes sont définies comme des segments chromosomiques qui sont clairement distinguables des segments adjacents,elles apparaissent claires ou foncées après utilisation de la technique des bandes. Les régions chromosomiques sont divisées en bandes. Les bandes à l’intérieur des régions sont aussi comptées sur chaque bras du centromère vers le télomère. Pour désigner les bandes chromosomiques, on spécifie le numéro du chromosome, le bras, le numéro de la région et le numéro de la bande au niveau de la région, nommés dans l’ordre sans espace, ni ponctuation. Par exemple, 1 p 31(chromosome 1, bras court, région 3, bande 1) désigne la première bande de la 3ème région du bras court du chromosome 1.
Le banding de haute résolution divise les bandes chromosomiques en sous bandes, qui sont des régions claires ou sombres constituant des structures plus fines à l’intérieur des bandes chromosomiques.
Les caryotypes sont décrits suivant le système international de la nomenclature de la cytogénétique humaine. La description du caryotype commence par le nombre total de chromosomes incluant les chromosomes sexuels puis une liste d’anomalie des autosomes suivant l’ordre numérique ascendant. Un caryotype mâle est 46, XY (figure 1) et le caryotype femelle normal est 46, XX (figure 2). Les abréviations communes et les symboles utilisés pour décrire les caryotypes sont listés dans le tableau 1.

Figure 1 : Caryotype masculin 46 XY

Figure 2 : Caryotype féminin 46XX

VI. les anomalies chromosomiques :
Les anomalies chromosomiques peuvent être des anomalies de nombre ou de structure et peuvent êtres aussi constitutionnelles ou acquises. Le terme anomalie chromosomique numérique définit un caryotype avec un nombre anormal de chromosomes. Les anomalies chromosomiques numériques incluent la perte ou le gain d’un chromosome. Les anomalies chromosomiques structurales sont des altérations de la structure de certains chromosomes incluant la perte, le réarrangement ou le gain de segments chromosomiques. Les anomalies chromosomiques numériques et structurales peuvent coexister dans les cellules malignes.
1- Les anomalies chromosomiques numériques :
Une cellule contenant un nombre normal de chromosomes, de structure normale, est appelée diploïde. Les cellules avec 46 chromosomes, mais avec des anomalies chromosomiques numériques (par exemple perte et gain d’un autre) ou avec des anomalies de structure sont appelées pseudo diploïdes. La présence d’un nombre anormal de chromosomes est appelée aneuploïdie.
Les cellules avec plus de 46 chromosomes sont appelées hyperdiploïdes, tandis que la présence de moins de 46 chromosomes est appelée hypodiploïdie. La perte d’une copie d’un chromosome réalise une monosomie pour ce chromosome. Le gain d’une copie pour un chromosome réalise une trisomie pour ce chromosome. Plus rarement, un chromosome gagne deux copies additionnelles réalisant une tétrasomie .

La perte d’un chromosome est indiquée sur le caryotype par un signe moins suivi, par le chiffre du chromosome intéressé, tandis que le gain d’un chromosome est indiqué par le signe plus suivi par le chiffre du chromosome intéressé. Le nombre de chromosomes dans la cellule, donné par le caryotype, reflète ce qu’elle a perdu ou gagné. Par exemple, 45, XY,-7 indique une cellule mâle qui a perdu une copie du chromosome 7(monosomie7) ; 47XX, +8 indique une cellule femelle qui a gagné une copie du chromosome8 (trisomie 8) et 48, XY, +13 +13 est une cellule mâle avec deux copies additionnelles du chromosome 13 (tétrasomie 13).

2. Les anomalies chromosomiques de structure

Une variété d’anomalies chromosomiques de structure peut être présente dans les cellules tumorales. Des termes avec des définitions précises et des abréviations sont utilisés pour décrire ces changements

2.1. La délétion (del.)
Une délétion chromosomique (del.) est la perte d’un segment de chromosome. Les délétions peuvent être soit terminales soit interstitielles.
• Dans la délétion interstitielle, un segment chromosomique interne est perdu et le segment chromosomique proximal et distal au segment perdu, sont juxtaposés. Ainsi la del. (5) (q13 q33) désigne une délétion interstitielle du bras long du chromosome 5 entre les bandes q13 et q33.

• Dans une délétion terminale l’extrémité d’un bras du chromosome est absente ainsi la del. (7) q22 désigne une délétion terminale du chromosome 7 avec une cassure au niveau de la bande q 22 et la perte de tout le matériel chromosomique entre la bande 7q22 et le télomère 7q.

Figure 3 : Délétion terminale et interstitielle.

2.2. L’isochromosome (fig. 4)
Un isochromosome (i) est une anomalie chromosomique de structure qui consiste en deux bras chromosomiques identiques positionnés comme des images en miroir c,est a dire deux bras court identiques sans bras long ou l,inverse . Les isochromosomes peuvent être monocentriques (un centromère) ou dicentriques (deux centromères).Les iso chromosomes les plus courants dans les hémopathies malignes sont i (11q), i (17) et i (21q) dans les LAM, i (7 q), i (9 q) et i (17 q) dans les LAL, i (9q), i (17q) et i (22q) dans les LMC.

2.3. La translocation
Une translocation chromosomique est un déplacement de matériel d’un chromosome à un autre chromosome. Les translocations sont habituellement réciproques. Une translocation réciproque est un échange de matériel d’un chromosome à un chromosome différent, elle n’intéresse habituellement que deux chromosomes et rarement plus que deux, enfin les translocations non réciproques sont rares
Un grand nombre de translocations ont été décrites dans les hémopathies malignes. Dans de nombreux cas, les anomalies moléculaires associées, ont été identifiées et les mécanismes de la transformation maligne ont été élucidés.
Au cours des leucémies aigues certaines translocations s’accompagnent d’une synthèse de facteurs de transcription aberrants. Ainsi dans les leucémies aigues promyelocytaires, la t (15 ; 17) (q22 ; q11-12), le gène du récepteur α de retinoique α (RARα) du chromosome 17 est fusionné au gène PML au niveau 15q 22. Ainsi le gène hybride (PML/RARα) obtenu code pour un facteur de transcription aberrant qui inhibe la différenciation promyélocytaire
-Certaines translocations entraînent une activation d’un oncogène il s,agit de la t(8 ;14 ) (q24 ;q23 ) dans le lymphome de burkitt, la t (8 ; 14 ) (q24 ;q11 ) dans la LAL de type T et la t (14 ;18 ) (q32 ;q21) dans les lymphomes non hodgkiniens folliculaires. Dans la t (8 ;14 ) (q24 ;32 ) ,l’oncogène c-myc au niveau 8q24 est juxtaposé au gène de la chaîne lourde de l’immunoglobuline au niveau de 14q32, entraînant une dysrégulation de la transcription du c-myc .Dans la t(8 ;14) (q24 ;q11) l’oncogène c-myc est activé par la juxtaposition du locus α/δ du récepteur des cellules T (39 ). Dans la t(14 ;18) (q32 ;q21), le gène BCL2 au niveau de 18q21 qui inhibe l’apoptose, est surexprimé par la juxtaposition du gène de la chaîne lourde de l’immunoglobuline au niveau 14q32.

Figure 5 : Translocation réciproque.

2.4. Le chromosome isodicentrique(idic)
Un chromosome isodicentrique (idic) est un iso chromosome avec deux centromères. Les chromosomes isodicentriques sont rares. Un exemple est idic (7p) L’idic (7p) consiste en deux copies du bras court et du centromère du chromosome 7, positionnées comme des images en miroir.

2.5. L’inversion (inv.)
Une inversion chromosomique (inv.) est une anomalie chromosomique de structure qui est une rotation de 180° d’un segment chromosomique c’est a dire un fragment de chromosome qui a change d’ orientation a l,intérieur même du chromosome. Les inversions peuvent être péricentriques ou paracentriques.
Dans les inversions péricentriques, le segment qui subit une rotation de 180° inclue le centromère. Dans les inversions paracentriques, le segment inverse est soit le bras long soit le bras court du chromosome et n’inclue pas le centromère.
Ainsi l’inv. (16) (p13q22) est une inversion péricentrique, tandis que l’inv. (3) (q21 q26) est paracentrique. Ces deux types d’inversion peuvent être observées dans les LAM (23). Un autre exemple d’inversion paracentrique est l’inversion (14) (q11q32) qui est l’anomalie chromosomique la plus caractéristique dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC) de type T et dans la leucémie pro lymphocytaire de type T(fig. 6 et 6 bis)

Figure 6 : inversion péricentrique.

Figure 7 bis : Inversion paracentrique.

2.6. Le chromosome en anneau (r)
Un chromosome en anneau (r) : ring en anglais est un chromosome anormal dans lequel des cassures sont retrouvées dans les bras longs et les bras courts du chromosome et les points de cassure des bras longs et courts se sont rejoints réalisant un cercle fermé ou anneau. Les chromosomes en anneau ne sont pas fréquents dans les hémopathies malignes, ils ont été d’abord rapportés dans les LAM et la LMC . Quelques cas,seulement de chromosomes en anneau ont ete rapportés dans les hémopathies lymphoïdes (fig7)

Figure 8 : Chromosome en anneau.

2.7. Le chromosome dicentrique (dic )
Un chromosome dicentrique (dic) est un chromosome de structure anormale qui a deux centromères. Les chromosomes dicentriques résultent de la translocation réciproque dans laquelle l’un des chromosomes contient les centromères des deux chromosomes impliqués par la translocation. Dans ce cas la méthode FISH peut être utile pour confirmer l’identité des centromères et le reste du matériel chromosomique dans le chromosome dicentrique.

2.8. L’addition (add)
Une addition chromosomique (add) est un gain de matériel chromosomique d’origine inconnue. Un signe plus (+) après le bras du chromosome désigne habituellement le gain de matériel chromosomique qui entraîne un allongement du bras. Par exemple, 14q+ indique la présence d’un matériel supplémentaire en 14q. L’existence d’un chromosome 14 anormal avec un matériel supplémentaire sur son bras long est généralement retrouvé au cours de la LLC.

2.9. Insertion (ins)
L’insertion (ins) est la présence d’un segment chromosomique dans une nouvelle position à l’intérieur du même chromosome, ou d’un autre chromosome. Les insertions sont très inhabituelles. Dans quelques cas, des anomalies de structure qui avaient été décrites d’abord comme des insertions ont été réinterprétées comme des translocations.(fig8)

2.10. Duplication (dup)
La duplication (dup) est la présence d’une copie supplémentaire d’un segment chromosomique, de telle sorte qu’il existe deux copies du même segment , juxtaposées au niveau du chromosome.

Figure 8 : insertion.

2.11. Double minutes (dmin)
Les chromosomes doubles minutes (dmin) sont des fragments de chromosomes de petite taille sans centromères ni bandes. Ce sont de petites structures sphériques qui ressemblent à des diplocoques. Les chromosomes double minutes sont plus souvent observés dans les tumeurs solides .

3. Les anomalies chromosomiques constitutionnelles et acquises
Les anomalies chromosomiques numériques et de structure peuvent être soit constitutionnelles, soit acquises.
3.1. Les anomalies chromosomiques constitutionnelles : elles sont présentes dans toutes ou presque toutes les cellules et existent dès le premiers stades de l’embryogenèse. Le caryotype constitutionnel de 99 % de la population est normal. L’anomalie constitutionnelle retrouvée chez les sujets apparemment normaux est une inversion péricentrique du chromosome 9, inv. (9) (p 11 q 13), qui est présente chez 1 % de la population. Une anomalie constitutionnelle est désignée par la lettre c, par exemple le caryotype des cellules d’une femme atteinte du syndrome de Down est 47, XX, + 21 c.

3.2. Les anomalies chromosomiques acquises

Elles peuvent se développer sur des cellules dont le caryotype était normal ou sur des cellules dont les patients avaient déjà une anomalie chromosomique constitutionnelle. Ainsi, le caryotype 47, XX, + 21, désigne une trisomie acquise chez une femme ayant un caryotype constitutionnel normal, par contre le caryotype 47, XX, +21 c désigne la cellule d’une femme présentant un syndrome de Down sans anomalie cytogénétique acquise. Enfin le caryotype 47, XX, t (8 ; 21) (q22 ; q22), +21 c est celui d’une femme présentant un syndrome de Down avec une anomalie cytogénétique acquise à type de translocation.

4. Définition cytogénétique de la clonalité.

Lorsque des anomalies cytogénétiques apparaissent dans une cellule, la cellule et sa descendance peuvent avoir un avantage de prolifération ou de survie, créant un clone qui est une population cellulaire provenant d’une seule cellule. Sur le plan cytogénétique, un clone est défini par un minimum de deux mitoses cellulaires avec un gain d’un même chromosome ou avec la même anomalie de structure ou trois mitoses cellulaires avec une perte d’un même chromosome. Les modifications cytogénétiques survenant dans un nombre insuffisant de cellules pour définir un clone, sont considérées comme des changements dus au hasard.

5. Les anomalies chromosomiques acquises, primaires et secondaires

• Les anomalies cytogénétiques primaires, sont des aberrations qui sont souvent
retrouvées comme des changements chromosomiques uniques aux affections malignes. De plus elles sont souvent associées avec des types spécifiques de tumeurs.
Les exemples d’anomalies cytogénétiques primaires sont la t (8 ; 21) (q22 ; q22)dans la leucémie aigue myeloblastique (LAM) de type M2 , l’inv (16) (p13 ; q22) dans la LAM4 et la t (15 ; 17) (q22, q11-21) dans les leucémie aigues a promyélocytes, la t (9 ; 22) (q34 ; q11) dans la leucemie myeloide chronique( LMC). Les anomalies cytogénétiques primaires sont liées à la pathogénie de la transformation maligne.
• Les anomalies cytogénétiques secondaires, sont des modifications qui surviennent
généralement en plus des anomalies primaires. Les anomalies secondaires telles que la trisomie (+8) peuvent être observées en association avec diverses anomalies primaires.

Tableau I : symboles et abréviations utilisés pour la description des Chromosomes
et les anomalies chromosomiques .

VI- Application a la pathologie hématologique :

L’analyse des chromosomes devient un examen incontournable pour le diagnostic des hémopathies malignes. Elle occupe une place déterminante dans leur évaluation pronostique, le choix de la stratégie thérapeutique et la recherche de la maladie résiduelle.

1. Syndromes myéloproliferatifs :

1.1 La LMC occupe indiscutablement une place a part, la cytogénétique signe son diagnostic par rapport aux autres syndromes myéloproliferatifs par la mise en évidence du chromosome Philadelphie : t (9 ; 22) s’exprimant par le transcrit bcr/abl à la biologie moléculaire. Toutefois il faut savoir que ce réarrangement n’est pas visible dans 5% des LMC.
La t (9 ; 22) (q34 ; q11) dans la LMC est une translocation réciproque entre les bras longs du chromosome 9 et du chromosome 22, les points de cassure sont au niveau de 9 q 34 et de 22 q11 (figure 5). La signification moléculaire du changement en t (9 ; 22) (q34 ; q11) est le déplacement de l’oncogène abl de 9 q 11 au niveau du locus bcr en 22 q 11 Un nouveau gène de fusion bcr /abl est créée qui code pour un nouvel RNA de fusion bcr/abl RNA dont l’expression est une augmentation de l’activité tyrosine kinase qui apparaît suffisante pour induire la transformation maligne.
Les anomalies chromosomiques surajoutées témoignant d’un état avancé de la maladie sont volontiers récurrentes : duplication du chromosome Philadelphie ;isochromosome 17q, trisomie 8 ou trisomie 19.

Les anomalies des autres syndromes myéloproliferatifs ont peu d’intérêt en pratique courante.

1.2 Polycythemie :la délétion du bras long du chromosome 20 peut etre rencontrée .

1.3Thrombocythemies essentielles : la trisomie 9 peut être retrouvée

2. Leucémies aigues :
Les anomalies cytogénétiques représentent un facteur pronostic indépendant de tous les autres facteurs et permet le choix du protocole thérapeutique optimal :

2.1. Leucémies aigues lymphoblastiques :
L’hyperdiploidie à plus de 50 chromosomes est corrélée a un excellent pronostic chez l’enfant
La t (12 ; 21) (p13 ; q22) : présente dans prés d’un quart des LAL pré B de l’enfant confère un pronostic favorable à la survie des patients.
A l’inverse, dans les LAL de l’adulte, les anomalies conférant un pronostic favorable sont rares l’hyperploidie supérieure à 50 chromosomes est décrite dans certaines séries.
Les autres anomalies sont corrélées à un pronostic défavorable, avec un très haut risque de rechute : t (9 ; 22) (q34 ; q11), anomalies de la région 11q23, t (1 ; 19).

2.2 .Leucémies aigues myéloblastiques :
la cytogénétique revêt une importance capitale essentiellement au plan pronostique .certaines anomalie sont spécifiques de certains types FAB et d’autres pas :
-Anomalies a pronostic favorable :
• inv. (16) t (16 ; 16)/ del (16q) spécifique des LAM4 éosinophiles
• t (15 ; 17) sans autres anomalies spécifique des LAM 3
• t (8 ; 21) sans del (9q) ou caryotypes complexes : spécifique des LAM2
-Anomalies a pronostic intermédiaire :
• Caryotype normal
• + 8, +6,-Y, del (12p)
• del (5q)/, -5, -7, del (7q)
• anomalies 3q, 9q, 11q, 20q, 21 et 17p
• t (6 ; 9), t (9 ; 22) et caryotypes complexes

-Anomalies a pronostic défavorable :

3. Syndromes Myélodysplasiques :
Les anomalies rencontrées sont souvent des anomalies de nombre et des pertes de matériel chromosomiques. Les plus fréquentes touchent les chromosomes 5 et 7
-Anomalies associés a un pronostic favorable :
• del (5q) isolée
• del (20q) isolée
• perte du chromosome Y isolée
-Anomalies à pronostic péjoratif :
• pertes affectant le chromosome 7
• caryotypes complexes

4. Lymphomes malins non hodgkinien : ( LMNH)
Les LMNH sont classés en différents sous groupes immunomorphologiques, la dernière classification la dernière en date est celle de l’OMS 2001 qui prend en compte les anomalies cytogénétiques. Les principales anomalies à valeur diagnostique sont :
• t (8 ; 14) (q24 ; q32) et ses variantes : lymphome de Burkitt
• t (11 ; 14) (q13 ; q32) : lymphome du manteau
• t (14 ; 18) (q 32 ; q21) : lymphome folliculaire
• t (2 ; 5) (p23 ; q35) et ses variantes : lymphome anaplasique
• t (11 ; 18) : MALT
Autres anomalies plus ou moins spécifiques :
• t (9 ; 14) : lymphome lymphoplasmocytaire
• Anomalie en 3q27

5 Leucémie lymphoïde chronique (LLC) :
Cette pathologie se caractérise par un faible index prolifératif, ce qui rend l’examen cytogénétique extrêmement difficile.
5.1 LLC B :
La Délétion du bras long du chromosome 13 en 13q14 est l’anomalie la plus fréquente. Les autres anomalies sont moins fréquemment retrouvées : trisomie 12, délétion de la région 11q23 et plus rarement de la région 17P13
5.2 LLC T :
• Inversion du chromosome 14 en 14q 32 impliquant le gène codant du récepteur T.
• Perte du bras court du chromosome 8

6. Myélome multiple :
les anomalies clonales ne sont retrouvées que dans 20 à 30%des cas en raison du faible index prolifératif des plasmocytes tumoraux alors que par FISH interphasique on les retrouve dans 50 à 60 % des cas . Les anomalies les plus fréquemment observées sont :
• Translocations variables en 14q32 impliquant toutes le gène IGH (chaîne lourde des immunoglobulines).la t (4 ; 14) (p16 ; q32) est spécifique du myélome multiple.

• Délétion du bras long du chromosome 13 en 13q14 : cette anomalie confère un pronostic très sombre particulièrement si elle est associée a la t (4 ; 14) ou a la délétion de la région 17p13

CONCLUSION : la cytogénétique est une discipline jeune .La connaissance de l’organisation des chromosomes a permis de rendre compte des particularités et des variations de l’ADN constitutif. A l’heure actuelle, l’apport cytogénétique est devenu indispensable à plusieurs pathologies humaines. En hématologie cet examen est incontournable en raison de l’intérêt diagnostique dans certaines pathologies tel que la LMC, l’intérêt pronostique indiscutable, l’intérêt thérapeutique notamment l’indication des thérapeutiques ciblées, et enfin le suivie de la maladie résiduelle.

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Application De La Cytogénétique A L’étude Des Leucémies Aigues
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9. Photos du service de cytogénétique de l’hôpital Cochin Paris France